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RNA-seq转录组学分析
📝 服务介绍
转录组分析对RNA-seq数据进行质控、比对、定量和差异分析，鉴定差异表达基因并开展功能注释（GO/KEGG/Reactome）和通路富集，是基因表达调控研究的核心分析手段。
🔬 实验原理
RNA-seq转录组分析原理：RNA-seq通过高通量测序全面检测转录本表达水平。总RNA/mRNA经建库(片段化/反转录/接头/PCR)后NGS测序，比对参考基因组后计算基因表达量(count→TPM/FPKM)，差异分析筛选DEGs，功能富集揭示调控通路。
📋 应用领域
- 差异表达基因鉴定
- 疾病/处理相关转录组分析
- 可变剪接与转录本异构体分析
- 基因共表达与调控网络构建
- 非编码RNA（lncRNA/circRNA）分析
- 药物与基因互作转录组探究
⭐ 服务优势
- 全转录组覆盖：mRNA/lncRNA/circRNA
- 差异基因鉴定：DESeq2/limma标准流程
- 功能注释：GO/KEGG/Reactome
- 可视化：火山图/热图/MA图
🔄 服务流程
- 原始数据质控（FastQC/MultiQC）
- 去接头和低质量reads（Trim Galore/fastp）
- 比对参考基因组（HISAT2/STAR）
- 基因定量（featureCounts/HTSeq）
- 差异基因分析（DESeq2/edgeR/limma）
- GO/KEGG/Reactome富集分析
- 可视化报告
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 测序数据 | FASTQ文件（含index信息） |
| 物种 | 注明物种及参考基因组版本 |
| 分组信息 | 对照组/实验组及生物学重复数 |
| 分析需求 | 标准差异分析/可变剪接/WGCNA/ceRNA |
| 报告要求 | 标准/深度定制 |
📊 结果展示
转录组分析报告（含PCA/火山图/热图/GO/KEGG富集、差异基因列表、可变剪接分析）。
📦 最终交付
转录组分析报告（含PCA/火山图/热图/GO/KEGG富集、差异基因列表、可变剪接分析）。
Q: RNA-seq需要多少重复
建议每组>=3生物学重复。生物学重复数越多统计检验越可靠。若样本量少可用Limma trend（经验贝叶斯方法）代替DESeq2降低小样本偏差。
Q: 差异基因Fold Change和p-value阈值怎么设
常规标准：|log2FC|>1且adjust p-value<0.05。可根据研究调整：严格(|log2FC|>2 padj<0.01)或宽松(|log2FC|>0.5 padj<0.1)。建议结合火山图可视化确认。
Q: RNA-seq怎么做
1)RNA提取(QIAazzo/Trizol, RIN>7)；2)rRNA去除(RiboZero)或mRNA富集(Oligo dT)；3)建库(片段化/反转录/二链合成/接头/PCR, Illumina TruSeq)；4)NGS测序(NovaSeq PE150, 20-50M reads/sample)；5)比对(HISAT2/STAR→BAM)；6)定量(featureCounts/HTSeq→count)；7)差异分析(DESeq2/edgeR)；8)功能富集(GO/KEGG/GSEA)。建议3生物学重复。
Q: RNA-seq和RT-qPCR区别
RNA-seq：全转录组高通量(20,000+基因)，发现新转录本/可变剪接/融合基因/mutation，但成本高(1000元/样本)且需生信分析。RT-qPCR：低通量(1-100基因)，高灵敏度/精确度，需设计引物(已知序列)，成本低(50元/样本)。RNA-seq发现→RT-qPCR验证关键基因。建议RNA-seq初筛→RT-qPCR验证DEGs。
Q: RNA-seq差异基因怎么分析
1)count矩阵(DESeq2/edgeR标准化)；2)差异分析(DESeq2: Wald test/ edgeR: exact test或QLF)；3)阈值: |log2FC|>1且padj<0.05(BH校正)；4)火山图(log2FC vs -log10(padj))；5)热图(pheatmap/ComplexHeatmap聚类)；6)GO/KEGG富集(clusterProfiler)；7)GSEA(基因集富集分析,不需阈值)。建议DESeq2+GSEA(互补: 阈值法+排序法)。
Q: RNA-seq能做什么
1)基因表达差异(疾病vs正常/处理vs对照)；2)可变剪接分析(rMATS/MASS/SpliceQ)；3)融合基因检测(Star-Fusion/Arriba)；4)SNV/InDel检测(GATK/RNA-SeQC variant calling)；5)非编码RNA(lncRNA/miRNA/circRNA)；6)单细胞转录组(scRNA-seq)；7)空间转录组(Visium)。建议根据研究目的选择建库方法(总RNA-seq/mRNA-seq/smallRNA-seq)
Q: RNA-seq需要多少测序量
mRNA-seq: 20-30M reads(PE150)/样本(标准基因表达分析)。可变剪接/融合基因: 50-100M reads(需更深覆盖)。lncRNA/circRNA: 50-100M reads(需rRNA去除)。smallRNA-seq: 5-10M reads(SE50, 不需片段化)。建议≥3生物学重复。Illumina NovaSeq PE150。测多不如测深(重复>深度)：3重复×20M好于2重复×30M。
Q: RNA-seq数据质控怎么做
1)测序质量(FastQC/MultiQC: Q30>80%, GC含量正常)；2)比对率(STAR/HISAT2: >80% reads比对参考基因组)；3)基因body覆盖均匀性(RSeQC: 5'/3'偏倚<2倍)；4)重复性(PCA/correlation: 生物学重复PCA聚类一致)；5)检测基因数(≥15,000 genes detected)；6)外显子/内含子比例(>60%外显子)。每步检查排除异常样本。