搜索基因编辑
CRISPR-Cas9基因敲除/敲入
📝 服务介绍
CRISPR-Cas9基因编辑利用sgRNA引导Cas9核酸酶在基因组特定位点产生DNA双链断裂，通过NHEJ或HDR实现基因敲除（KO）或敲入（KI），是新一代基因组编辑核心技术。
🔬 实验原理
CRISPR基因编辑原理：CRISPR-Cas9是细菌获得性免疫系统的基因工程工具。sgRNA引导Cas9核酸酶至靶序列(PAM上游)，Cas9在靶位点产生DNA双链断裂(DSB)，通过NHEJ(非同源末端连接，引入Indel)或HDR(同源定向修复，精确敲入)实现基因敲除或敲入。
📋 应用领域
- CRISPR-Cas9基因敲除模型构建
- 单碱基编辑/基因敲入(KI)
- 基因编辑效率评估与脱靶分析
- 类器官/原代细胞基因编辑
- 遗传疾病模型细胞构建
- 多基因联合编辑
⭐ 服务优势
- 精准编辑：sgRNA可靶向任意基因组位点
- 多功能：KO/KI/点突变/条件性KO
- 高效：敲除效率可达30-80%
- 兼容多种细胞：肿瘤/原代/iPSC
🔄 服务流程
- sgRNA设计与合成（在线工具+脱靶分析）
- sgRNA+Cas9质粒或RNP电转入细胞
- 单克隆化培养（有限稀释法）
- T7E1错配切割酶法初筛
- Sanger测序确认编辑类型
- 表达验证（WB/qPCR确认敲除效果）
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 靶基因信息 | 基因名称/物种/NCBI Gene ID |
| 编辑类型 | KO/KI/点突变/条件性 |
| 细胞系 | 指定细胞系及培养条件 |
| 敲入模板 | KI需提供供体DNA模板（含同源臂） |
📊 结果展示
编辑细胞系（冻存管）、sgRNA序列信息、T7E1/测序鉴定报告、表达验证报告（WB/qPCR）。
📦 最终交付
编辑细胞系（冻存管）、sgRNA序列信息、T7E1/测序鉴定报告、表达验证报告（WB/qPCR）。
Q: CRISPR脱靶效应如何评估
使用Cas-OFFinder等工具预测脱靶位点，对Top 5-10脱靶位点Sanger测序验证。推荐使用高保真Cas9变体（eSpCas9/SpCas9-HF1）降低脱靶率。
Q: 基因敲除后蛋白仍检测到条带怎么办
可能sgRNA设计在外显子内部，移码突变后仍产生截短蛋白。建议sgRNA设计在5端constitutive exon，使用N端抗体确认。
Q: CRISPR基因编辑怎么做
1)设计sgRNA(在线工具Benchling/CRISPOR，选高效率低脱靶)；2)合成sgRNA oligo→克隆至载体(pSpCas9(BB)-2A-GFP)或体外转录sgRNA；3)转染(质粒/RNP蛋白复合体)→电穿孔/Lipofectamine；4)72-96h后筛选(GFP FACS/抗生素)；5)单克隆扩大→基因型鉴定(T7E1/PCR+Sanger测序)；6)验证蛋白敲除(WB)。
Q: sgRNA怎么设计
1)在线工具(Benchling/CRISPOR/Cas-Designer)输入靶基因序列→输出候选sgRNA(20nt+N(G→PAM=NGG))；2)评分：效率评分(Doench/Rule Set 2)选>0.5的，特异性评分(无脱靶)选>80的；3)设计2-3条sgRNA平行验证(不同靶位点)；4)避免起始密码子附近(影响修复阅读框)；5)编码区选择(早期外显子大移码敲除)。设计3条sgRNA选效率最高的。
Q: CRISPR怎么验证敲除
1)T7E1酶切(错配切割法)：PCR扩增靶区域→变性退火→T7E1酶切(切割杂合DSW)→凝胶电泳看切割条带；2)Sanger测序：PCR扩增→测序→TIDE/ICE分析分解色谱图(Indel频率和类型)；3)Western Blot：抗体检测蛋白是否敲除(金标准)；4)免疫荧光：组织/细胞中蛋白表达消失确认。
Q: CRISPR脱靶怎么评估
1)生物信息学预测(CRISPOR/Cas-OFFinder)选脱靶位点评分低的sgRNA；2)Sanger测序验证预测的高风险脱靶位点(PCR扩增靶区域→测序)；3)全基因组测序(WGS)无偏倚检测脱靶突变(对照组vs编辑组)；4)RNP(蛋白复合体)减少脱靶(瞬时表达Cas9降低脱靶窗口)。建议设计2-3条sgRNA+脱靶位点Sanger验证。
Q: CRISPR敲入怎么做
1)设计sgRNA(敲入位点)+供体模板(同源臂500-1000bp+目的片段)；2)转染sgRNA-Cas9+供体模板(ssODN小片段或质粒大片段)；3)HDR修复将目的片段敲入靶位点；4)筛选(同源重组鉴定PCR+测序)。敲入效率低(HDR 1-10%)需筛选。优化：1)同步细胞至S/G2期(HDR活跃)；2)NHEJ抑制剂(S1-Scr7);3)RNP电穿孔效率高。