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mRNA原位杂交
📝 服务介绍
原位杂交利用标记的核酸探针与组织切片中靶mRNA互补杂交，在原位检测基因表达水平，兼顾组织结构信息和表达定位，特别适合空间异质性表达研究。
🔬 实验原理
ISH原理：原位杂交利用标记(地高辛/荧光/同位素)的核酸探针与组织/细胞切片中靶mRNA/miRNA/lncRNA互补配对杂交，通过酶联抗体(DAB/NBT-BCIP)或荧光检测信号位置，实现RNA在组织中的原位定位和表达分析。
📋 应用领域
- mRNA/lncRNA组织及细胞定位
- 基因表达空间表达模式分析
- 病原体核酸原位检测
- 病毒基因组组织定位
- miRNA原位表达检测
- 发育生物学基因时空表达谱
⭐ 服务优势
- 原位定位：直接在组织中原位检测mRNA
- 高特异性：探针与靶序列精准互补
- 组织结构保持：结合形态学观察
- 兼容多种探针：cRNA/oligo探针
🔄 服务流程
- 组织固定包埋切片
- 蛋白酶K消化增加通透性
- 预杂交（减少非特异背景）
- 探针杂交（37-42C过夜）
- 梯度SSC洗涤（逐步增加严格性）
- 抗地高辛-AP抗体孵育
- NBT/BCIP显色
- 封片观察
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 组织样本 | 石蜡切片或冰冻切片 |
| 靶基因序列 | mRNA序列信息用于探针设计 |
| 探针类型 | cRNA/oligo DNA探针或委托设计 |
| 检测方式 | 地高辛/荧光标记 |
📊 结果展示
原位杂交图片（显色/荧光信号定位）、阳性/阴性对照结果、实验报告。
📦 最终交付
原位杂交图片（显色/荧光信号定位）、阳性/阴性对照结果、实验报告。
Q: 原位杂交背景高怎么降低
增加预杂交步骤、提高洗涤温度或降低SSC浓度（增加严格性）、增加蛋白酶K消化时间、使用含甲酰胺的杂交液。
Q: mRNA降解导致信号弱怎么办
全程RNase-free操作（DEPC处理器皿、戴口罩）、组织离体后快速固定（30min内入固定液）、使用新鲜配制试剂。
Q: ISH探针类型怎么选
RNA探针(riboprobe)：cRNA探针，灵敏度高适合低丰度RNA。寡核苷酸探针：短链20-50nt，特异性高可区分同源序列。LNA探针：锁核酸修饰，miRNA检测首选。FISH探针：荧光标记，可多重染色。根据RNA类型和丰度选择。
Q: ISH信号弱怎么办
1)探针浓度不足；2)杂交温度不合适(37-55°C过夜)；3)组织固定过度(4%PFA 4h以内)；4)蛋白酶K消化不充分(组织需10-20μg/mL 37°C 15min)；5)信号放大(TSA系统/BrdU检测)；6)RNA酶污染(全程DEPC处理)
Q: ISH和RT-qPCR怎么选
ISH：原位定位，显示RNA在组织/细胞中的空间分布，半定量。RT-qPCR：高灵敏度定量，但需裂解组织失去空间信息。研究空间分布选ISH，精确表达定量选RT-qPCR。两者配合：ISH定位+qPCR定量。
Q: ISH如何防止RNA降解
全程DEPC水处理耗材试剂、戴手套、RNase-free工作区、组织新鲜取材后立即固定(4%PFA 4°C)或液氮速冻、切片后-80°C保存。杂交buffer用DEPC水配制。蛋白酶K和缓冲液用RNase-free级别。
Q: 地高辛和荧光标记怎么选
地高辛(DIG)：需抗地高辛抗体-酶联检测(DAB/NBT)，灵敏但步骤多。荧光(FISH)：直接荧光显微镜观察，可多重染色但灵敏度稍低。低丰度RNA用地高辛+TSA放大。多重染色用荧光标记。