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甲基化特异性PCR与测序
📝 服务介绍
DNA甲基化检测通过亚硫酸氢盐处理将未甲基化C转化为T，结合MSP/BSP/甲基化芯片分析CpG岛甲基化状态，是表观遗传学研究的核心技术，用于肿瘤标志物开发等。
🔬 实验原理
DNA甲基化检测原理：DNA甲基化是5'-CpG岛胞嘧啶C5位的甲基化修饰，调控基因表达。亚硫酸氢盐处理将未甲基化C转化为T，甲基化C保持不变，通过PCR/测序/芯片/NGS检测甲基化状态，用于表观遗传调控和肿瘤标志物研究。
📋 应用领域
- 肿瘤抑癌基因启动子甲基化与表达沉默
- 表观遗传调控机制研究
- 甲基化标志物辅助肿瘤早期诊断
- 疾病相关甲基化谱差异分析
- CpG岛/增强子甲基化状态检测
- 药物表观遗传学与去甲基化药效评价
⭐ 服务优势
- 多方法可选：MSP/BSP/焦磷酸测序/850K芯片
- 全基因组覆盖：850K芯片覆盖85万+CpG位点
- 精准定量：BSP克隆测序可定量每个CpG位点
- 支持液体活检：cfDNA甲基化检测
🔄 服务流程
- 基因组DNA提取与质量检测
- 亚硫酸氢盐处理（C->T转化）
- MSP引物设计/BSP扩增/芯片杂交
- PCR扩增、测序或芯片扫描
- 甲基化水平分析与可视化
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| DNA样品 | 浓度>=20ng/uL，体积>=30uL，完整度高 |
| 目标区域 | 基因名/CpG岛位置/启动子区域信息 |
| 检测方案 | MSP定性/BSP定量/芯片全基因组 |
| 样本类型 | 细胞/组织/全血/cfDNA均可 |
📊 结果展示
交付甲基化分析报告，包含MSP电泳图/BSP测序图/芯片火山图和热图、各CpG位点甲基化率统计表。
📦 最终交付
交付甲基化分析报告，包含MSP电泳图/BSP测序图/芯片火山图和热图、各CpG位点甲基化率统计表。
Q: 亚硫酸氢盐转化效率如何评估
设置已知甲基化/非甲基化DNA对照，转化效率应>99%。若内参ACTB扩增效率正常且C->T转化率达标，可认为转化可靠。
Q: BSP测序克隆数需要多少个
建议每样本每片段挑取10-15个克隆测序，获得统计学可靠的甲基化率。差异较大可增至20个克隆。
Q: DNA甲基化检测方法有哪些
1)MSP(甲基化特异性PCR)：设计甲基化/非甲基化引物PCR，定性检测特定CpG甲基化；2)BSP(亚硫酸氢盐测序)：亚硫酸处理后PCR扩增+克隆Sanger测序，单CpG分辨率；3)焦磷酸测序：定量单个CpG甲基化比例；4)甲基化芯片(850K/935K)：全基因组CpG甲基化；5)WGBS/RRBS：全基因组/减少表示亚硫酸测序。验证选MSP/焦磷酸测序，全基因组选WGBS/芯片。
Q: 亚硫酸氢盐处理怎么做
1)DNA定量(500ng-2μg)；2)亚硫酸氢钠处理(3M NaHSO3 pH5.0 50-55°C 12-16h，将未甲基C→U→T)；3)纯化回收DNA(试剂盒)；4)DNA转化率>99%(未甲基C→T)。商业化试剂盒(Zymo EZ DNA Methylation)简便。处理DNA片段化严重(<500bp)，PCR扩增效率降低需优化。
Q: 甲基化PCR(MSP)怎么做
1)亚硫酸处理DNA；2)设计甲基化引物(M，模板中CpG的C→C保持)和非甲基化引物(U，CpG的C→T转化)；3)PCR扩增；4)凝胶电泳判断：M引物扩增=甲基化阳性，U引物扩增=非甲基化。设阳性对照(体外甲基化DNA)、阴性对照(非甲基化DNA)和空白对照。MSP定性半定量。
Q: 甲基化检测和RNA-seq怎么关联
1)甲基化↓→基因表达↑(启动子低甲基化=基因激活)；2)甲基化↑→基因表达↓(启动子高甲基化=基因沉默)；3)增强子甲基化与表达正相关(部分情况)。整合分析：甲基化+RNA-seq→发现甲基化调控的靶基因。肿瘤中抑癌基因启动子高甲基化(沉默)和原癌基因启动子低甲基化(激活)是经典表观调控。
Q: 甲基化检测需要多少DNA
MSP：500ng-1μg基因组DNA(亚硫酸处理后损失50-80%)。BSP：500ng-1μg。焦磷酸测序：500ng-1μg(每PCR产物10-20ng上机)。850K芯片：500ng-1μg。WGBS：1-5μg(全基因组覆盖)。RRBS：100-500ng。FFPE DNA可用(片段化不严重时)。建议提取后尽快使用避免降解。