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体外蛋白互作验证
📝 服务介绍
GST Pull-down将GST标签诱饵蛋白固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上，与细胞裂解液或纯化猎物蛋白孵育，通过GST标签富集检测互作蛋白，是验证蛋白-蛋白直接互作的经典体外方法。
🔬 实验原理
GST Pull-down原理：重组GST融合蛋白(诱饵)固定在GSH珠上，与细胞裂解液孵育捕获互作蛋白(猎物)，洗涤后WB/质谱鉴定互作蛋白。是体外验证蛋白-蛋白互作的经典方法。
📋 应用领域
- 重组蛋白-蛋白体外互作验证
- 结构域介导的特异性结合研究
- GST融合蛋白亲和纯化互作
- 蛋白-多肽/核酸体外结合
- 诱饵蛋白结合伙伴初步筛选
- 蛋白间结合亲和力定性评估
⭐ 服务优势
- 验证直接互作：体外纯化系统
- 可控条件：可调整浓度/盐离子/时间
- 双向验证：诱饵/猎物可互换标签
- 兼容质谱：发现未知互作
🔄 服务流程
- GST融合蛋白表达纯化
- GST蛋白固定GSH珠
- 与猎物蛋白/细胞裂解液孵育
- 洗涤去除非特异结合
- SDS-PAGE电泳
- Western Blot或质谱检测
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 诱饵蛋白 | GST融合蛋白序列或纯化蛋白 |
| 猎物蛋白 | 细胞裂解液或纯化蛋白 |
| 检测方式 | WB/质谱 |
| 对照设置 | GST-only对照/Input对照 |
📊 结果展示
Pull-down WB图（含GST对照）、实验报告。
📦 最终交付
Pull-down WB图（含GST对照）、实验报告。
Q: GST Pull-down背景高怎么办
增加洗涤严格性（NaCl 300-500mM+0.1% NP-40）、增加洗涤次数（5-8次）、预清除裂解液（GSH珠预先孵育去除非特异）、设GST-only对照扣除背景。
Q: 诱饵蛋白不溶怎么办
GST融合蛋白在大肠杆菌中易形成包涵体。尝试低温诱导（16-25C 0.1mM IPTG）、换用MBP/Trx标签提高溶解性、或改用哺乳细胞表达纯化。
Q: GST Pull-down和Co-IP怎么选
Co-IP：内源性抗体捕获生理互作(内源性蛋白量)，但依赖抗体。Pull-down：重组诱饵蛋白捕获互作蛋白，不需抗体但需纯化诱饵蛋白(可能非生理浓度)。生理互作验证选Co-IP，初筛互作蛋白或验证直接互作选Pull-down。建议Pull-down初筛→Co-IP验证。
Q: GST Pull-down做不出来怎么办
1)GST融合蛋白纯度不够(SDS-PAGE确认>90%纯度)；2)诱饵蛋白无活性(变性纯化需复性→建议可溶表达4°C)；3)互作弱/间接(加交联剂)；4)猎物丰度低(增加裂解液量5-10mg)；5)洗涤太强(减少NP-40至0.1%)；6)GST标签干扰(改用His/Flag标签)。
Q: GST Pull-down对照怎么设
1)GST alone对照(空GST珠排除GST本身非特异结合)；2)Input(裂解液10-20%确认猎物蛋白表达)；3)阴性对照(突变互作域的诱饵蛋白)；4)阳性对照(已知互作蛋白对)。GST alone是最重要对照排除GST标签的非特异结合。
Q: GST融合蛋白纯化注意事项
1)BL21表达4°C 0.1mM IPTG过夜(可溶表达避免包涵体)；2)裂解液含1% Triton帮助溶膜蛋白；3)GSH珠4°C结合2h；4)洗涤3-5次(PBS+0.1%Triton)；5)Elution 10mM GSH或3mM GST；6)SDS-PAGE确认纯度>90%；7)BCA定量。蛋白量10-50μg/反应。
Q: GST Pull-down能检测直接互作吗
Pull-down用重组诱饵蛋白+细胞裂解液，检测的是直接+间接互作(裂解液含多种蛋白)。检测直接互作需用纯化的两个重组蛋白做Pull-down(无裂解液)。直接互作也可用SPR/ITC(表面等离子体共振/等温滴定)做定量(亲和力KD)。