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微滴式数字PCR
📝 服务介绍
数字PCR将反应体系分配至数万个微滴中，通过终点荧光读取阳性微滴比例，利用泊松统计计算靶分子绝对拷贝数，无需标准曲线即可实现绝对定量。特别适用于低丰度突变检测。
🔬 实验原理
微滴式数字PCR原理：将PCR反应体系分散为数万个纳升级微滴，每个微滴含0或1个靶标分子，在微滴内独立进行PCR扩增后逐个检测荧光信号，通过泊松统计计算靶标分子的绝对拷贝数，无需标准曲线即可实现绝对定量。
📋 应用领域
- 稀有突变检测（血液ctDNA、单碱基突变）
- 拷贝数变异(CNV)绝对定量
- 基因表达量绝对定量（无需标准曲线）
- NGS文库质控与精确定量
- 转基因生物成分检测
- 病毒低载量感染检测
⭐ 服务优势
- 绝对定量：无需标准曲线
- 超高灵敏度：可检测0.01%突变频率
- 高耐受抑制剂：对样本质量要求低
- 稀有突变首选：液体活检/MRD监测
🔄 服务流程
- 样本DNA/RNA提取与浓度测定
- 反应体系配制
- 微滴生成
- PCR扩增（40循环）
- 微滴读取与泊松统计分析
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| DNA样品 | 浓度>=10ng/uL，体积>=20uL |
| 引物探针序列 | 提供名称/序列/修饰信息或委托设计 |
| 突变位点信息 | 明确检测位点及野生型/突变型序列 |
| 对照样本 | 如需阳性对照请提供或委托合成 |
📊 结果展示
交付实验报告含微滴荧光散点图、阳性/阴性微滴统计表、靶基因绝对拷贝数及浓度计算结果。
📦 最终交付
交付实验报告含微滴荧光散点图、阳性/阴性微滴统计表、靶基因绝对拷贝数及浓度计算结果。
Q: 数字PCR和qPCR如何选择
qPCR适合相对定量（基因表达差异分析），数字PCR适合绝对定量和低频突变检测。若需检测<1%的突变频率或精确拷贝数，选数字PCR。
Q: 微滴生成失败常见原因
主要为样品含过量去污剂、DNA浓度过高导致粘度大、封油不充分。建议纯化DNA、稀释至推荐浓度。
Q: dPCR和qPCR有什么区别
dPCR：微滴分区后独立扩增，检测终点荧光信号(阳/阴性微滴比例)，通过泊松统计绝对定量，不依赖标准曲线，灵敏度高(0.001%)，适合低丰度/拷贝数变异检测。qPCR：实时监测扩增过程Ct值，需标准曲线相对定量，灵敏度高但受扩增效率影响。绝对定量/低丰度选dPCR，常规定量选qPCR。
Q: dPCR灵敏度多少
可检测0.001%(1/100,000)的突变频率，远高于qPCR(0.1-1%)。每个微滴是独立PCR反应，低拷贝模板的微滴也能扩增阳性。适合MRD(微小残留病灶)监测、稀有突变检测、cfDNA液体活检。Bio-Rad QX200/QX ONE系统。每个样本可检测20,000+微滴。
Q: dPCR能检测什么
1)基因突变/SNP绝对定量(等位基因频率)；2)拷贝数变异(CNV)检测；3)基因表达绝对定量(无需内参校正)；4)病原体绝对定量(病毒载量/细菌)；5)MRD监测(Ig/TCR重排)；6)液体活检(ctDNA/MI)；7)GMO检测。无需标准曲线是最大优势。
Q: dPCR微滴生成失败怎么办
1)样本粘度高(加更多稀释或蛋白酶K消化)；2)微滴生成油过期(更换新批次)；3)探针/引物浓度过高(降低引物至900nM)；4)PCR体系有气泡(离心去泡)；5)微滴生成芯片堵塞(清洁或更换)。每次设阳性对照(已知拷贝)和阴性对照(无模板)。微滴生成后应在1h内扩增。
Q: dPCR结果怎么看
阳性微滴数/总微滴数→泊松统计校正(考虑微滴体积和模板分布)→计算拷贝数/μL。报告：copies/μL或copies/ng DNA。突变检测报告突变频率(MAF)=突变拷贝/(突变+野生型拷贝)×100%。CNV检测报告拷贝数比值(目的基因/参考基因)。设NRT(无逆转录)和NTC(无模板)对照。