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Co-IP 蛋白-蛋白互作
📝 服务介绍
免疫共沉淀利用特异性抗体在细胞裂解液中捕获靶蛋白及其结合伙伴，通过Western Blot或质谱鉴定互作蛋白，是研究蛋白-蛋白相互作用经典方法。
🔬 实验原理
Co-IP原理：利用特异性抗体在非变性条件下捕获靶蛋白，与其形成复合物的互作蛋白被共沉淀。Protein A/G磁珠捕获抗体-蛋白复合物，洗脱后WB/质谱鉴定互作蛋白。是研究生理条件下蛋白-蛋白互作的金标准。
📋 应用领域
- 蛋白-蛋白相互作用验证
- 内源蛋白复合物鉴定
- 信号通路蛋白复合体分析
- 诱饵/猎物蛋白结合构象研究
- 不同处理条件下的互作差异
- 蛋白翻译后修饰介导的互作
⭐ 服务优势
- 生理条件检测：保留天然互作
- 可信度高：体内验证互作
- 可发现新互作：结合质谱发现新伙伴
- 兼容可逆/瞬时互作
🔄 服务流程
- 细胞裂解（RIPA+蛋白酶抑制剂）
- 抗体+Protein A/G磁珠孵育
- 免疫沉淀（4C 2h-过夜）
- 洗涤（含不同盐浓度洗5次）
- SDS上样缓冲液煮沸洗脱
- Western Blot检测互作蛋白
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 细胞/组织样品 | 细胞>=10^7或组织>=200mg |
| 抗体信息 | IP抗体名称/品牌/货号/宿主种属 |
| 互作蛋白检测 | WB抗体名称或质谱鉴定 |
| 裂解条件 | 温和裂解（1% NP-40/Triton X-100） |
| 对照设置 | IgG阴性对照/Input阳性对照 |
📊 结果展示
Co-IP结果图（Input/IP/IgG对照）、互作蛋白WB验证图、实验报告。
📦 最终交付
Co-IP结果图（Input/IP/IgG对照）、互作蛋白WB验证图、实验报告。
Q: Co-IP检测不到互作蛋白怎么办
排查：抗体IP效率低（先验证Input中靶蛋白表达）、互作弱或瞬时（用交联剂DSP/DTSSP固定）、洗涤条件过强（降低NaCl浓度至150mM）、裂解条件过强（改用温和裂解液0.5% NP-40）。
Q: Co-IP和GST Pull-down有何区别
Co-IP检测生理条件下的天然互作（内源蛋白）；GST Pull-down检测重组蛋白间互作（体外验证）。Co-IP更接近体内真实情况，GST Pull-down可验证直接互作。
Q: Co-IP和Pull-down有什么区别
Co-IP：内源性抗体捕获天然蛋白复合物，检测生理互作，但依赖抗体质量和蛋白丰度。Pull-down：重组蛋白(带标签GST/His)作为诱饵捕获互作蛋白，不需抗体但需表达纯化诱饵蛋白，可能检测非生理互作。生理互作验证选Co-IP，初筛互作选Pull-down。
Q: Co-IP拉不下来互作蛋白怎么办
1)裂解液太剧烈(Triton >1%破坏弱互作→用0.5%Triton或CHAPS/NP-40)；2)抗体亲和力不足(增加抗体用量5-10μg/500μg蛋白)；3)蛋白丰度低(增加起始量1-2mg蛋白)；4)互作弱/瞬时(加交联剂DSS/DTSSP固定)；5)洗涤太强(减少洗涤次数3-5次用低盐)
Q: Co-IP如何设对照
1)Input(总蛋白裂解液，10-20%)；2)阴性对照(IgG同型对照抗体，排除非特异结合)；3)阴性对照(不加抗体的Beads only)；4)阳性对照(已知互作蛋白对)。Input和IP同时做WB，Input确认蛋白表达，IgG排除非特异。Beads only排除珠子非特异吸附。
Q: Co-IP裂解液怎么选
温和裂解液(保留互作)：NP-40 0.5-1%或Triton X-100 0.5%。中等：RIPA(含SDS 0.1%)。强裂解液(破坏互作)：SDS 1%煮沸。Co-IP建议用0.5% NP-40+50mM Tris pH7.4+150mM NaCl+1mM EDTA+蛋白酶抑制剂。膜蛋白互作用1% Triton+1% CHAPS更好。
Q: 膜蛋白Co-IP怎么做
膜蛋白疏水难溶解，需特殊裂解液：1)1% Triton X-100+1% CHAPS(混合去垢剂更好溶膜)；2)1% Digitonin(温和不破坏膜蛋白复合物)；3)避免SDS(破坏跨膜互作)。需更长时间(30-60min 4°C旋转裂解)。也可用BN-PAGE(蓝绿胶非变性电泳)分析膜蛋白复合物。