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交联免疫沉淀测序
📝 服务介绍
CLIP-seq利用UV交联固定RNA-蛋白直接接触，免疫沉淀后RNase消化、接头连接、测序，在全转录组范围绘制RNA结合蛋白精确结合位点，分辨率达单碱基级别。
🔬 实验原理
CLIP原理：UV(254nm)交联固定RBP-RNA→裂解→RNase部分消化RNA→免疫沉淀RBP-RNA复合物→SDS-PAGE分离→膜转移→切膜提取RNA→建库测序，提供RBP在RNA上的单碱基分辨率结合位点。
📋 应用领域
- 全基因组RNA结合蛋白结合位点检测
- RBP结合motif鉴定与验证
- 可变剪接/RNA稳定性调控网络
- miRNA/lncRNA互作生物学网络
- RNA加工与出核调控研究
- 疾病相关RBP失调分析
⭐ 服务优势
- 单碱基分辨率：精确定位RBP结合位点
- 直接互作：UV交联仅固定直接接触
- 全转录组覆盖：无偏倚扫描
- 多变体：HITS-CLIP/iCLIP/eCLIP/PAR-CLIP
🔄 服务流程
- UV 254nm交联活细胞（400 mJ/cm2）
- 细胞裂解
- RNase部分消化（保留结合片段50-100nt）
- 抗体免疫沉淀
- 3接头连接、32P标记
- SDS-PAGE转膜
- 切膜提取RNA
- RT-PCR建库测序
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 细胞/组织 | >=10^7细胞 |
| 抗体信息 | RBP抗体（需经CLIP验证） |
| CLIP变体 | HITS-CLIP/iCLIP/eCLIP/PAR-CLIP |
| 测序深度 | 20-40M reads/样本 |
| 分析需求 | 结合位点检出/基序分析/注释 |
📊 结果展示
CLIP-seq分析报告（含结合位点峰图、基序分析、靶RNA注释、Meta-gene分布）。
📦 最终交付
CLIP-seq分析报告（含结合位点峰图、基序分析、靶RNA注释、Meta-gene分布）。
Q: CLIP-seq和RIP-seq如何选择
CLIP-seq精确定位RBP结合位点（单碱基级），适合机制研究；RIP-seq检测整体富集RNA但分辨率低。若需确定精确结合位点选择CLIP-seq，若仅需确定靶标RNA选择RIP-seq。
Q: CLIP实验建库效率低怎么办
eCLIP使用改进的建库流程（免去32P标记、使用strict wash）提高效率且更安全。也可使用Adapter RT代替gellan method。建议使用eCLIP（ENCODE标准方法）。
Q: CLIP和RIP区别
CLIP：UV交联固定后RNase消化+凝胶纯化，提供单碱基分辨率结合位点，步骤复杂但精度高。RIP：不做UV交联，捕获完整RNP复合物，操作简单但无结合位点分辨率(只能知道结合哪些RNA)。精确定位结合位点选CLIP，初筛靶标选RIP。HITS-CLIP=iCLIP/eCLIP都是CLIP变体。
Q: CLIP变体有哪些
HITS-CLIP(CLIP-seq)：经典方法，RNase消化后SDS-PAGE纯化。PAR-CLIP：4SGU培养+365nm UV交联，T→C突变标记结合位点。iCLIP：捕获截断cDNA获得交叉位点精确位置。eCLIP：配对Input对照+改进建库降低背景。建议eCLIP(信噪比高可重复性好)或iCLIP(单碱基精度)。
Q: CLIP实验需要多少细胞
建议10⁷-10⁸细胞(因UV交联效率约1-5%且多步骤损失)。核RBP可用核提取物减少起始量。低丰度RBP需要更多细胞。可做 Spike-in(加已知浓度非人源RNA)做绝对定量。iPSC/原代细胞量少可做eCLIP改进版(需10⁵-10⁶)。
Q: CLIP-seq下游分析
1)Reads去接头/去重复；2)比对参考基因组(允许 mismatch标记交联位点)；3)Peak calling(Piranha/CLIPper)；4)Motif分析(RBP结合基序)；5)注释结合位点在mRNA上的位置(5'UTR/CDS/3'UTR/intron)；6)与RNA-seq整合(RBP敲除后差异表达)；7)二级结构预测(RNAfold)。
Q: UV交联条件怎么选
UV 254nm 150-400 mJ/cm²(活细胞冰上)。UV 254nm直接交联嘧啶(主要是U-C交联)。PAR-CLIP用4SGU(4-thiouridine)培养12-16h后UV 365nm交联(效率更高)。UV后立即裂解防止光修复。UV穿透力弱需单层细胞或组织切片。过交联降低RNA提取效率。