搜索酵母双杂交
Y2H 蛋白互作筛选
📝 服务介绍
酵母双杂交利用转录因子GAL4的DNA结合域（BD）和激活域（AD）分别融合诱饵和猎物蛋白，当两蛋白互作时BD和AD重构恢复转录因子活性，激活报告基因表达，用于筛选和验证蛋白互作。
🔬 实验原理
酵母双杂原理：将诱饵蛋白(X)融合DNA结合域(BD)，猎物蛋白(Y)融合激活域(AD)。X-Y互作重建转录因子活性，激活报告基因(HIS3/ADE2/LacZ)表达，通过营养缺陷筛选和蓝白斑验证蛋白-蛋白互作。
📋 应用领域
- 酵母双杂交大规模蛋白互作筛查
- 文库筛选鉴定新互作伙伴
- 蛋白-蛋白互作图谱构建
- 全长/截短蛋白互作域定位
- 诱饵蛋白互作网络初筛
- 基因功能与信号通路关联发现
⭐ 服务优势
- 大规模筛选：可筛cDNA文库发现新互作
- 体内检测：酵母细胞内互作
- 成本低：不需纯化蛋白
- 验证与筛选一体：单实验可筛选+验证
🔄 服务流程
- 构建BD-诱饵 + AD-猎物载体
- 共转酵母菌株（Y2HGold等）
- 双重筛选缺陷培养基（-Leu/-Trp/-His/-Ade）
- X-a-gal显色验证
- 阳性克隆测序鉴定互作蛋白
- 回转验证消除假阳性
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 诱饵蛋白 | CDS序列或cDNA |
| 猎物来源 | cDNA文库/已知蛋白/筛选库 |
| 酵母菌株 | Y2HGold/NMY1等 |
| 检测模式 | 一对一验证/文库筛选 |
| 对照设置 | 阳性对照/阴性对照/自激活检测 |
📊 结果展示
酵母生长照片、阳性克隆鉴定报告、互作蛋白序列信息及实验报告。
📦 最终交付
酵母生长照片、阳性克隆鉴定报告、互作蛋白序列信息及实验报告。
Q: Y2H假阳性率高怎么办
设置严格对照（空AD载体/已知不互作蛋白）、增加筛选严格性（3-AT抑制His3本底）、回转验证（将BD-猎物/AD-诱饵交换验证）、Co-IP体内验证确认。
Q: 诱饵蛋白自激活怎么办
检测BD-诱饵单独是否激活报告基因。若自激活：增加3-AT浓度（5-50mM）、换用更严格菌株（Y2HGold含多报告基因）、缩短诱饵序列去除激活域。
Q: Y2H和Co-IP怎么选
Y2H：体内检测直接互作(酵母细胞)，高通量筛选互作蛋白，但假阳性高(不需生理浓度)。Co-IP：内源性检测生理互作(哺乳动物细胞)，但依赖抗体/丰度。大规模互作筛选选Y2H，生理互作验证选Co-IP。建议Y2H初筛→Co-IP验证。
Q: Y2H假阳性怎么排除
1)设阴性对照(无关蛋白做诱饵/猎物)；2)反向验证(交换BD/AD融合方向)；3)3-AT浓度梯度筛选(HIS3报告基因抑制背景)；4)多种报告基因确证(HIS3+ADE2+LacZ三重)；5)回转化验证(重新转化确认)；6)Co-IP/SPR体外验证。只报告至少两个报告基因阳性的互作。
Q: Y2H能检测膜蛋白互作吗
经典核Y2H不适合膜蛋白(膜蛋白需在膜上折叠)。用膜酵母双杂(MbYTH)：诱饵和猎物融合在膜上的Cub和Nub碎片，互作重建泛素连接酶活性释放转录因子。适合膜蛋白-膜蛋白互作。也可用Split-UB系统。膜蛋白互作验证选MbYTH+Co-IP。
Q: Y2H文库筛选怎么做
1)构建cDNA文库(猎物AD融合)；2)诱饵BD融合转化酵母；3)文库转化(效率>10⁶克隆)；4)缺陷培养基筛选(SD/-Leu/-Trp/-His+3-AT)；5)阳性克隆提取质粒测序鉴定互作蛋白。需设自激活检测(诱饵单独是否自激活报告基因)。建议筛≥10⁶克隆确保覆盖度。
Q: Y2H和哺乳动物双杂区别
Y2H：酵母细胞表达，操作简便高通量但非生理环境(无哺乳动物PTM)。哺乳动物双杂(MaMTH)：哺乳动物细胞，蛋白正确折叠/PTM/更生理但通量低。膜蛋白/需PTM的蛋白选MaMTH，高通量初筛选Y2H。