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凝胶迁移阻滞实验
📝 服务介绍
EMSA利用蛋白与标记的DNA/RNA探针结合后电泳迁移速度变慢的原理，通过非变性凝胶检测蛋白-核酸互作，是研究转录因子-DNA结合的经典方法。
🔬 实验原理
EMSA原理：电泳迁移率实验(凝胶阻滞实验)。蛋白与荧光/同位素标记的DNA/RNA探针结合后，复合物在非变性凝胶中迁移率低于游离探针，形成阻滞条带，检测蛋白-核酸互作及特异性。
📋 应用领域
- 转录因子-DNA结合实验
- 凝胶迁移检测蛋白-DNA互作
- 竞争/超迁移实验鉴定结合特异性
- 突变识别关键结合碱基
- 蛋白-核酸复合物定性
- 转录调控机制体外验证
⭐ 服务优势
- 高灵敏度：可检测nM级结合
- 可视化：直接观察结合/游离条带
- 竞争实验：超移和竞争验证特异性
- 兼容突变分析：突变探针定位结合位点
🔄 服务流程
- 设计合成生物素/同位素标记探针
- 蛋白提取（核提取物）
- 蛋白-探针孵育结合反应
- 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 转膜检测（化学发光/放射自显影）
- 竞争实验（未标记探针竞争）
- 超移实验（抗体超移）
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 蛋白样品 | 核提取物或纯化蛋白 |
| 探针序列 | DNA/RNA序列信息（5端标记） |
| 标记方式 | 生物素/同位素P32 |
| 实验类型 | 定性结合/竞争验证/超移/突变分析 |
| 对照设置 | 阴性对照/竞争对照/超移对照 |
📊 结果展示
EMSA凝胶图片（结合条带/游离探针/竞争/超移）、实验报告。
📦 最终交付
EMSA凝胶图片（结合条带/游离探针/竞争/超移）、实验报告。
Q: EMSA检测不到结合条带怎么办
确认蛋白活性（新鲜核提取物避免冻融）、探针标记效率（生物素标记效率>50%）、结合条件优化（Mg2+/甘油/BSA/poly dI-dC非特异竞争剂）。建议先做预实验。
Q: EMSA竞争实验如何设置
加入50-100倍摩尔过量未标记特异性探针竞争结合（应消除条带）；加入等量突变探针不竞争（条带应保留）。两者对比验证结合特异性。
Q: EMSA探针标记方式
1)生物素标记(Biotin-EMSA，最常用，安全简便，需化学发光检测)；2)同位素P³²标记(经典灵敏但需放射防护)；3)荧光标记(FAM/Cy5，可直接荧光成像)；4)DIG标记(地高辛抗体检测)。建议生物素标记(商业化试剂盒安全简便)或荧光标记(快速无废液)。
Q: EMSA怎么设竞争对照
冷竞争：加100倍未标记(冷)探针与标记探针竞争结合蛋白。如果冷探针能消除特异条带=特异性结合。突变竞争：加突变探针(结合位点突变)不能消除特异条带=确认序列特异性。Super-shift：加抗体与蛋白结合使条带进一步迁移变慢=确认蛋白身份。
Q: EMSA和ChIP区别
EMSA：体外检测纯化蛋白/核提取物与特定DNA序列的结合，定性/半定量，检测直接结合。ChIP：体内检测蛋白在染色质上的结合位点，需要交联和抗体，检测基因组范围结合。EMSA适合验证特定序列/蛋白直接结合，ChIP适合体内基因组范围定位。两者互补。
Q: EMSA做不出阻滞条带怎么办
1)蛋白量不足(增加核提取物5-10μg或纯化蛋白)；2)探针量过多(降低探针浓度使蛋白为限制因素)；3)结合条件不对(检查Buffer: 10mM Tris+50mM KCl+1mM DTT+5%甘油+poly dI-dC 1μg)；4)蛋白失活(现提核蛋白避免冻融)；5)结合位点不对(检查探针序列)。
Q: EMSA非特异条带多怎么办
1)增加非特异竞争物poly dI-dC(1-5μg)；2)增加poly dA-dT(1μg)；3)降低核提取物用量；4)优化KCl浓度(50-100mM)；5)加BSA(1mg/mL)减少非特异吸附；6)降低探针浓度。设冷竞争对照(加100x冷探针)确认特异条带。