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蛋白质免疫印迹
📝 服务介绍
Western Blot通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白、转膜后用特异性抗体检测目标蛋白表达水平，是蛋白定性、半定量分析的经典方法，用于蛋白表达验证、信号通路分析、翻译后修饰检测等。
🔬 实验原理
Western Blot原理：SDS-PAGE凝胶电泳按分子量分离蛋白，转膜（PVDF/NC）将蛋白转移至固相载体，抗体特异性识别靶蛋白，通过酶标记二抗（HRP/AP）催化底物（ECL）产生化学发光信号，成像后定性/半定量分析。
📋 应用领域
- 目标蛋白表达水平半定量分析
- 信号通路蛋白活化状态检测（磷酸化/修饰）
- 基因过表达/敲低后蛋白水平验证
- 蛋白-蛋白互作蛋白量确认
- 抗体特异性和效价验证
- 疾病标志物蛋白表达筛查
⭐ 服务优势
- 高特异性：抗原-抗体精准识别
- 半定量：可比较不同样本间蛋白表达差异
- 修饰检测：搭配修饰抗体可检测磷酸化/乙酰化等
- 技术成熟：年检测量超5000张膜
🔄 服务流程
- 细胞/组织裂解提取总蛋白
- BCA定量，统一上样量（20-40ug）
- SDS-PAGE电泳分离
- 转膜（PVDF/NC），封闭
- 一抗4C过夜，二抗室温1h
- ECL化学发光显影，灰度分析
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 细胞/组织样品 | 细胞>=10^6或组织>=50mg |
| 一抗信息 | 名称/品牌/货号/宿主种属/稀释比 |
| 内参抗体 | GAPDH/actin/Tubulin等，可由平台提供 |
| 蛋白分子量 | 已知则提供，未知则查询确认 |
📊 结果展示
交付完整WB图片（含marker、内参、目的蛋白条带）、灰度值比值统计表及实验报告。
📦 最终交付
交付完整WB图片（含marker、内参、目的蛋白条带）、灰度值比值统计表及实验报告。
Q: WB背景过高如何优化
常见原因：抗体浓度过高（做梯度稀释预实验）、封闭不充分（延长封闭或换5%BSA）、洗膜不充分（增加Tween-20）、曝光过长。
Q: 目的蛋白条带位置偏移怎么办
确认蛋白翻译后修饰（磷酸化导致迁移变慢）、前体蛋白与成熟形式分子量差异、剪切体变体。建议查阅UniProt确认。
Q: 条带出现非特异性条带怎么办
优化一抗浓度（1:500~1:5000梯度摸索）、一抗孵育温度（4°C过夜减少非特异）、增加洗膜次数（0.1% TBST洗5min×5次）、设置阴性对照（敲除/敲down样品）、更换抗体批次或抗体。
Q: 条带信号弱怎么增强
增加上样量（20-50μg/孔）、延长曝光时间（5-30min）、使用高灵敏度ECL（超敏ECL可检测fg级蛋白）、提高一抗/二抗浓度、延长一抗孵育时间（4°C过夜）。确认蛋白是否低表达。
Q: 内参条带不齐怎么办
确保等量上样（BCA定量后调整）、充分匀浆、上样前离心去除不溶物。内参选择：GAPDH/β-actin适合总蛋白；Lamin B1适合核蛋白；COX IV适合线粒体蛋白；Na/K-ATPase适合膜蛋白。
Q: 膜重复使用怎么 stripping
Stripping buffer（0.5M NaCl+0.5M甘氨酸pH2.5 或 0.2M NaOH 5min）洗去抗体，TBST洗涤后重新封闭加抗体。建议stripping不超过2-3次。强stripping可能损伤蛋白，建议先检测弱带后检测强带。
Q: 磷酸化蛋白检测注意事项
必须加磷酸酶抑制剂（NaF/Na₃VO₄）防止去磷酸化、样品全程冰上操作、避免反复冻融、磷酸化抗体4°C过夜孵育、先做总蛋白再做磷酸化确保丰度足够。
Q: 分子量偏移怎么判断
翻译后修饰导致偏移：磷酸化+80Da/位点、泛素化+8.5kDa、糖基化+2-3kDa（N-糖）。剪切/降解导致变小。截短突变/可变剪接可能出现多个条带。结合预测工具（NetPhos/OGP)分析。