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微量热泳动技术
📝 服务介绍
MST利用红外激光产生温度梯度，检测分子在温度梯度中的热泳动行为。当配体结合时热泳动行为改变，通过检测荧光信号变化测定分子间亲和力（KD），无需固定、在溶液中检测。
🔬 实验原理
MST原理：微量热泳动技术。分子在红外激光加热的微小温度梯度中发生热泳动(迁移率取决于分子大小/电荷/水合层)，结合配体后泳动行为改变，通过荧光检测分子移动变化，定量分子互作亲和力(KD)。
📋 应用领域
- 蛋白-蛋白/蛋白-小分子/蛋白-核酸相互作用
- 微量热泳动无标记结合检测
- 溶液中原位结合亲和力测定
- 无需纯化标签的天然互作
- 离子浓度/mode对结合影响
- 高质量小分子互作定性
⭐ 服务优势
- 溶液中检测：无需固定保持天然构象
- 无需纯化：兼容细胞裂解液
- 低样品量：仅需uL级样品
- 检测范围广：pM-mM跨6个数量级
🔄 服务流程
- 荧光标记配体（或使用内源荧光蛋白）
- 梯度稀释分析物
- 等体积混合配体和分析物
- 填充毛细管至MST仪
- 红外激光加热检测热泳动信号
- 拟合曲线计算KD
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 配体 | 荧光标记的分子（或自带荧光蛋白） |
| 分析物 | 梯度稀释的未标记分子 |
| 标记方式 | 荧光染料（NT-647/Red）/His标签荧光抗体/融合GFP |
| 缓冲液 | PBS+0.05% Tween-20 |
| 样品量 | 配体>=10pmol 分析物>=100pmol |
📊 结果展示
MST结合曲线图、KD值、实验报告。
📦 最终交付
MST结合曲线图、KD值、实验报告。
Q: MST和SPR/BLI如何选择
MST在溶液中检测无需固定，适合膜蛋白和易变构蛋白；SPR/BLI需要固定在表面，适合动力学参数测定。若仅需KD值选MST最简便，需完整动力学参数选SPR。
Q: MST信号弱怎么办
确认荧光标记效率（>50%）、标记后蛋白活性未受影响（做活性验证）、分析物浓度覆盖KD前后2-3个数量级梯度、缓冲液加0.05% Tween-20防止吸附。
Q: MST和SPR区别
MST：均相溶液中检测(无需固定)，样品量少(4-6μL)，无需纯化蛋白(可用裂解液)，检测亲和力(KD)但不测动力学(kon/koff)。SPR：固定化检测，需纯化蛋白，需大量样品，测动力学和亲和力。MST适合快速KD测定和低丰度样品，SPR适合精确动力学表征。两者互补。
Q: MST荧光标记怎么做
1)荧光标记蛋白(NHS-染料/His标签荧光探针NT-647)；2)荧光融合蛋白(GFP/mCherry标签直接检测)；3)色氨酸荧光(280nm紫外检测无需标记但灵敏度低)。建议His标签荧光探针(NT-647-Ni-trisNTA)标记His标签蛋白1:1定向标记不影响活性。GFP融合蛋白直接检测最简便。
Q: MST能检测小分子-蛋白互作吗
可以。小分子作为非荧光配体(梯度稀释)，荧光标记蛋白为检测分子。小分子结合改变蛋白热泳动行为。需荧光标记蛋白(不能用小分子标记)。小分子KD范围nM-mM均可。优势：小分子不需标记，适合药物筛选。注意：小分子溶剂(DMSO)需≤5%且各组一致。
Q: MST需要多少样品
荧光分子(蛋白)：4-10μL/浓度(10-100nM)。非荧光配体(梯度)：4-10μL/16个浓度梯度(从μM到mM)。总样品量<50μg蛋白。微量毛细管(Nanotemper Monolith)仅需4μL/管。不需纯化蛋白可直接用细胞裂解液。适合稀有/低丰度蛋白(如原代细胞核提取物)。
Q: MST数据怎么分析
Nanotemper MO.Affinity Analysis软件拟合。1)Fnorm(归一化荧光)vs浓度曲线；2)S型曲线拟合计算KD；3)检查Hot/Cold区域(区分特异性结合和聚集)；4)T-Jump(温度跳跃)和T-Vis(红外检测)信号评估。R²>0.8为合格。建议≥2次独立实验。设阳性对照(已知KD互作)验证系统。