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实时荧光定量PCR
📝 服务介绍
RT-qPCR通过荧光信号实时监测PCR扩增进程，结合2^-DDCt法对靶基因进行精确定量，是基因表达分析的"金标准"。
🔬 实验原理
RT-qPCR原理：利用荧光染料（SYBR Green）或特异性探针（TaqMan）在PCR扩增过程中实时检测荧光信号。SYBR Green结合双链DNA后荧光增强；TaqMan探针在扩增时被切割释放荧光。通过Ct值（循环阈值）与标准曲线对比，实现靶基因精确定量。2^-ΔΔCt法将靶基因Ct值经内参基因校正后计算相对表达量。
📋 应用领域
- 基因表达定量与差异表达分析
- 药物处理/siRNA/shRNA干预后靶基因表达验证
- 肿瘤标志物与疾病相关基因筛查
- RNA病毒载量检测（拷贝数绝对定量）
- miRNA/lncRNA/circRNA表达分析
- 临床样本基因分型与诊断辅助
⭐ 服务优势
- 高灵敏度：可检测单拷贝级别模板
- 高特异性：TaqMan探针或SYBR Green双重验证
- 通量灵活：支持96/384孔板
- 多重检测：支持多靶基因同时检测
🔄 服务流程
- RNA提取与质量检测（OD260/280>=1.8）
- 逆转录合成cDNA
- 引物/探针设计与预实验优化
- qPCR扩增（40循环+熔解曲线）
- 数据分析：2^-DDCt法计算相对表达量
📋 服务详情 / 客户提供
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| RNA/细胞/组织样品 | 新鲜或冻存，细胞>=10^6，组织>=50mg |
| 引物序列 | 提供靶基因名称/序列或委托设计 |
| 内参基因 | GAPDH/actin等，可由平台提供 |
| 实验分组 | 对照组/实验组明确，重复>=3 |
📊 结果展示
交付完整报告，包含RNA质检图、扩增曲线、熔解曲线、相对表达量柱状图（含统计检验）及原始Ct数据。
📦 最终交付
交付完整报告，包含RNA质检图、扩增曲线、熔解曲线、相对表达量柱状图（含统计检验）及原始Ct数据。
Q: qPCR熔解曲线出现杂峰怎么办
杂峰通常由引物二聚体或非特异性扩增引起。建议优化退火温度（梯度PCR）、降低引物浓度、检查引物特异性（BLAST比对），必要时重新设计引物。
Q: RNA提取后OD260/280偏低怎么办
比值<1.8提示蛋白污染。可增加氯仿抽提次数、减少样本用量；若样品富含蛋白建议使用TRIzol重抽。
Q: 内参基因选择有什么讲究
内参基因应稳定表达且不受实验处理影响。常用GAPDH、β-actin、18S rRNA，但不同组织/处理条件下稳定性不同。建议用GeNorm或NormFinder软件评估多个候选内参稳定性后选择。肿瘤组织GAPDH可能变化，建议用TBP或HPRT1。
Q: Ct值过大或无扩增怎么办
Ct>35可能为低表达或引物问题。检查：1)RNA/cDNA质量（是否降解）；2)引物特异性（BLAST比对）；3)扩增效率（标准曲线R²>0.99，效率90-110%）；4)模板浓度（过低可提高用量）。确认无扩增则为基因不表达或引物失败。
Q: 如何判断扩增效率是否合格
制作5倍或10倍梯度稀释标准曲线，slope应在-3.1~-3.6之间（效率90-110%），R²>0.99。效率<90%可能引物不佳或模板抑制；效率>110%可能非特异性扩增或引物二聚体。SYBR Green需看熔解曲线确认单峰。
Q: 组织样品RNA提取困难怎么办
纤维组织（肌肉/皮肤/心脏）难提取：液氮研磨后立即加TRIzol匀浆；脂肪组织去脂后再提取；骨组织需EDTA脱钙。可用试剂盒配合机械匀浆或蛋白酶K消化。RNA易降解，全程冰上操作，DEPC水浸泡耗材。